1.檢測細胞代謝活性

檢(jian)測細(xi)胞(bao)(bao)的(de)代(dai)謝(xie)活(huo)(huo)性(xing)也(ye)可以反映細(xi)胞(bao)(bao)增殖(zhi)的(de)情(qing)況(kuang)。在細(xi)胞(bao)(bao)增殖(zhi)過程(cheng)中乳酸脫(tuo)氫酶(mei)的(de)活(huo)(huo)性(xing)會增加，而活(huo)(huo)性(xing)的(de)脫(tuo)氫酶(mei)可以使(shi)得外(wai)源性(xing)的(de)四唑鹽或者(zhe)阿爾(er)瑪藍(lan)(Alamar blue)還原成為帶有顏色還原產物。通過分光(guang)光(guang)度計或者(zhe)酶(mei)標儀(yi)來(lai)讀取含染料培養(yang)基的(de)吸(xi)光(guang)度，從而衡量細(xi)胞(bao)(bao)的(de)代(dai)謝(xie)活(huo)(huo)性(xing)，檢(jian)測細(xi)胞(bao)(bao)增殖(zhi)的(de)情(qing)況(kuang)。

四(si)種zui常(chang)見的四(si)唑鹽是：MTT、XTT、MTS和WST1，其還原(yuan)產物(wu)為甲瓚(formazan)。

(1)四甲基偶氮唑鹽法(MTT)：MTT商品名為噻唑藍，是一種黃色的染料。1983年Mosmann建立MTT比色法，用于檢測細胞存活和增殖。其原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍紫色結晶，甲瓚并沉積在細胞中，而死亡的細胞無此功能。二甲亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫分析儀測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數量范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。MTT可以用于所有細胞類型，但MTT在標準的細胞培養基中是不溶的，而且其生成的甲瓚晶體需要溶解在DMSC)中。因此，MTT主要作為終點檢測方法。另外，有研究發現過氧化物會降低MTT測定的準確度，抑制將近95％，的MTT與O₂^-的(de)反應，MTT溶解產物甲瓚會(hui)吸附(fu)在納米(mi)纖(xian)維上，而致使檢測的(de)結(jie)果呈現假陰(yin)性(xing)。

(2)二甲(jia)氧唑黃比(bi)色法(XTT)：XTT是一種與MTT類似的四唑氮衍生物(wu)，可被活細(xi)胞還(huan)原(yuan)形成水溶性的橘(ju)黃色的甲(jia)瓚產物(wu)，不形成顆(ke)粒，可直接(jie)用酶聯免疫分(fen)析儀檢測(ce)吸光度，故較MTT法更加(jia)快(kuai)速、簡便、敏感(gan)。

但XTT水溶液不穩定，需要低溫保存，現配現用。由于XTT的代謝產物呈橘黃色，故培養體系中有些黃色代謝物和試劑可能會影響其檢測結果。與MTT一樣，過氧化物可抑制近95％的XTT與O₂^-的(de)反應，故對(dui)XTT測定的(de)準確度有一定的(de)影響。

(3)內(nei)鹽法(fa)(MTS)：MTS是一種(zhong)新(xin)型的(de)MTT類似(si)物。MTs在(zai)(zai)偶(ou)聯(lian)劑PMS存(cun)在(zai)(zai)的(de)條件下，可被活(huo)細胞(bao)線(xian)粒體(ti)中的(de)多(duo)種(zhong)脫氫酶還原成水(shui)溶性的(de)有色(se)甲瓚產物，其顏色(se)深淺(qian)與活(huo)細胞(bao)數量(liang)在(zai)(zai)一定范圍(wei)內(nei)呈高(gao)度相關(guan)，可用(yong)酶標儀檢測。它的(de)優點(dian)在(zai)(zai)于無放射性、快(kuai)速(su)、安(an)全、方便、靈(ling)活(huo)及特異性強，同時又克(ke)服了MTT、XTT的(de)缺(que)點(dian)。

(4)四唑(zuo)單鈉鹽法(WST-1)：WST-1是(shi)水(shui)溶(rong)(rong)性(xing)四唑(zuo)鹽試劑，是(shi)一(yi)(yi)種(zhong)類(lei)似(si)于(yu)MTT的(de)(de)化合(he)物，在(zai)電子耦(ou)合(he)試劑存在(zai)的(de)(de)情況下，可(ke)(ke)以(yi)(yi)(yi)被(bei)線(xian)粒(li)(li)體(ti)內的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)(xie)脫氫(qing)酶(mei)還原(yuan)生成(cheng)橙黃色(se)的(de)(de)甲(jia)瓚。細(xi)胞(bao)增殖越多越快，則顏色(se)越深；細(xi)胞(bao)毒性(xing)越大，則顏色(se)越淺。WST-1是(shi)MTT的(de)(de)一(yi)(yi)種(zhong)升級(ji)替代產(chan)品(pin)(pin)，和MTT或(huo)其他MTT類(lei)似(si)產(chan)品(pin)(pin)如(ru)XTT、MTS等相比有明顯的(de)(de)優點。首先，MTT被(bei)線(xian)粒(li)(li)體(ti)內的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)(xie)脫氫(qing)酶(mei)還原(yuan)生成(cheng)的(de)(de)甲(jia)瓚不(bu)是(shi)水(shui)溶(rong)(rong)性(xing)的(de)(de)，需要(yao)由(you)特(te)定的(de)(de)溶(rong)(rong)解(jie)(jie)液來(lai)溶(rong)(rong)解(jie)(jie)：而WST-1和XTT、MTS產(chan)生的(de)(de)甲(jia)瓚都是(shi)水(shui)溶(rong)(rong)性(xing)的(de)(de)，可(ke)(ke)以(yi)(yi)(yi)省去后續的(de)(de)溶(rong)(rong)解(jie)(jie)步驟。其次，WST-1產(chan)生的(de)(de)甲(jia)瓚比XTT和MTS產(chan)生的(de)(de)甲(jia)瓚更(geng)易溶(rong)(rong)解(jie)(jie)。再次，WST-1比XTT和MTS更(geng)加穩(wen)定，加入WST-1顯色(se)后，可(ke)(ke)以(yi)(yi)(yi)在(zai)不(bu)同時(shi)間(jian)反復用酶(mei)標儀讀板(ban)，使檢測時(shi)間(jian)更(geng)加靈活，實驗結(jie)果更(geng)加穩(wen)定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，線(xian)性(xing)范(fan)圍更(geng)寬，靈敏度更(geng)高。

(5)Cell countjn譬(pi)kit-8(CCK-8)：CCK-8試劑中含有(you)WST-8。WST-8是近年新開發的(de)一種較WST-1更(geng)新的(de)水溶性(xing)四唑鹽，檢測原理與WST-1類似，但較WST-1更(geng)穩(wen)定(ding)，靈敏(min)度(du)更(geng)高(gao)(gao)，溶解性(xing)更(geng)強，更(geng)易于保存。CCK-8檢測細(xi)(xi)胞(bao)增殖、細(xi)(xi)胞(bao)毒(du)性(xing)實驗的(de)靈敏(min)度(du)比MTT、XTT及MTS更(geng)高(gao)(gao)，尤其(qi)適合于懸浮細(xi)(xi)胞(bao)，高(gao)(gao)通量藥(yao)物篩選。CCK-8法細(xi)(xi)胞(bao)毒(du)性(xing)低(di)，細(xi)(xi)胞(bao)檢測后(hou)還可(ke)重復利用，具(ju)有(you)更(geng)好(hao)的(de)實用性(xing)，可(ke)替代MTT法，具(ju)有(you)良好(hao)的(de)應用前景。

(6)阿(a)(a)爾瑪(ma)藍法：阿(a)(a)爾瑪(ma)藍檢測(ce)試劑為細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)增殖和(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)毒性(xing)檢測(ce)提(ti)供了一種簡便(bian)、快速、可(ke)靠、安全的方法。阿(a)(a)爾瑪(ma)藍在氧化狀態(tai)下呈現(xian)紫藍色無熒(ying)光(guang)(guang)性(xing)，而在還原狀態(tai)下轉變為呈粉紅(hong)或紅(hong)色熒(ying)光(guang)(guang)的還原產物，可(ke)以用普(pu)通分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計(ji)或熒(ying)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計(ji)進行檢測(ce)，吸光(guang)(guang)度和(he)熒(ying)光(guang)(guang)強度與活性(xing)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)數成(cheng)正比。阿(a)(a)爾瑪(ma)藍對細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)無毒、無害，不影響細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)代謝、細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)子分泌、抗體合成(cheng)等，可(ke)以對同一批(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的生長狀態(tai)進行連續觀察(cha)和(he)進一步的實驗。

MTT可(ke)以用(yong)于所有細胞(bao)類型，但(dan)MTT在(zai)標準的(de)(de)細胞(bao)培(pei)養基中(zhong)是不(bu)溶的(de)(de)，而且其生成的(de)(de)甲瓚晶體需要溶解(jie)在(zai)DMSO中(zhong)。因此，MTT主要作為終點(dian)檢測方法。其他三種鹽(yan)與(yu)阿(a)爾瑪(ma)藍一樣，都(dou)是可(ke)溶且無毒的(de)(de)。它(ta)們可(ke)以作為連續(xu)監(jian)控手段來跟蹤細胞(bao)增殖的(de)(de)動(dong)態改變。其中(zhong)XTT的(de)(de)效率(lv)較低(di)，需要添加額外的(de)(de)因子(zi)。而WST-1更靈(ling)敏有效，與(yu)其他鹽(yan)相比能夠(gou)(gou)更快顯色。阿(a)爾瑪(ma)藍的(de)(de)靈(ling)敏度也很高，只要微孔(kong)板的(de)(de)孔(kong)中(zhong)有100個細胞(bao)它(ta)就能夠(gou)(gou)檢測到。四唑鹽(yan)和(he)阿(a)爾瑪(ma)藍氧化(hua)還原染料(liao)能夠(gou)(gou)用(yong)于多種儀器(qi)和(he)高通量研究，非常方便。

2.檢測ATP含量

ATP是細胞(bao)能量的(de)(de)直接來源，細胞(bao)內的(de)(de)ATP含(han)量受(shou)到(dao)嚴格的(de)(de)調控，死(si)亡細胞(bao)或(huo)即將(jiang)死(si)亡的(de)(de)細胞(bao)幾乎(hu)不舍ATP，在(zai)細胞(bao)溶解物或(huo)提取物中測(ce)得的(de)(de)ATP濃度(du)與細胞(bao)數(shu)之(zhi)間存在(zai)嚴格的(de)(de)線性關系。因此(ci)，檢測(ce)ATP也可以得到(dao)細胞(bao)增殖(zhi)的(de)(de)信息。

ATP檢測可(ke)(ke)以用成色反應、熒(ying)光(guang)(guang)、化學發光(guang)(guang)或同位素等方(fang)法(fa)(fa)實現。目前應用zui廣的方(fang)法(fa)(fa)基于螢火蟲熒(ying)光(guang)(guang)素酶(mei)(催化熒(ying)光(guang)(guang)素氧化，消耗ATP。如果有ATP存在，則(ze)熒(ying)光(guang)(guang)素就會發光(guang)(guang)，發光(guang)(guang)效(xiao)率*，發光(guang)(guang)量與ATP含量呈很好的線性關系，可(ke)(ke)以反映細胞(bao)內ATP的含量。

3.活細胞熒光標記

羥基熒(ying)(ying)光(guang)(guang)素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)是(shi)一種(zhong)可(ke)穿透細胞(bao)(bao)膜的(de)(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)染料，CFSE能夠輕易(yi)穿透細胞(bao)(bao)膜，在(zai)活細胞(bao)(bao)內(nei)聚(ju)積(ji)并與胞(bao)(bao)內(nei)蛋白共價結合(he)，水解后的(de)(de)CFSE釋放出熒(ying)(ying)光(guang)(guang)物質，這些共價結合(he)的(de)(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)物分(fen)子(zi)很少從細胞(bao)(bao)內(nei)脫落。CFSE標記后的(de)(de)細胞(bao)(bao)用(yong)于體內(nei)觀(guan)察可(ke)以長(chang)達數周。當細胞(bao)(bao)分(fen)裂時，CFSE標記熒(ying)(ying)光(guang)(guang)可(ke)平均分(fen)配(pei)至兩個子(zi)代細胞(bao)(bao)中，因此其熒(ying)(ying)光(guang)(guang)強(qiang)度(du)是(shi)親代細胞(bao)(bao)的(de)(de)一半(ban)。這樣，在(zai)一個增殖的(de)(de)細胞(bao)(bao)群體，各(ge)連續代細胞(bao)(bao)的(de)(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)強(qiang)度(du)呈(cheng)對數遞(di)減，利用(yong)流(liu)式細胞(bao)(bao)儀在(zai)488nm激發光(guang)(guang)和熒(ying)(ying)光(guang)(guang)檢測通(tong)道可(ke)對其進行分(fen)析(xi)。

4.增強標記檢測

增殖細(xi)胞特異性地(di)表(biao)達(da)某(mou)些(xie)(xie)特定蛋白，利用(yong)特異性的(de)單抗來(lai)識別這(zhe)(zhe)些(xie)(xie)增殖細(xi)胞。例(li)如，在(zai)人體(ti)(ti)細(xi)胞中，Ki-67，PCNA等可以(yi)作為(wei)細(xi)胞增殖的(de)標志。但是，由于需要(yao)組織切片(pian)，這(zhe)(zhe)種方法(fa)(fa)(fa)無法(fa)(fa)(fa)進行(xing)高通量分析。不過這(zhe)(zhe)一方法(fa)(fa)(fa)頗受(shou)癌(ai)癥研究者(zhe)們的(de)青睞，因為(wei)它能夠(gou)用(yong)來(lai)檢測(ce)體(ti)(ti)內腫瘤細(xi)胞的(de)增殖。