1.直接計數法

是zui簡單(dan)的(de)(de)檢測細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)生長的(de)(de)方(fang)法。計數細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)一般利用臺盼藍(lan)(錐(zhui)蟲藍(lan)染色(se)(se)，臺盼藍(lan)(錐(zhui)蟲藍(lan))不能透(tou)過活(huo)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)正常完整的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)，故活(huo)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)不著色(se)(se)。而死亡細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)通透(tou)性增高，可使染料進(jin)入細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)內而使細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)著色(se)(se)。因(yin)此，鏡下未(wei)染色(se)(se)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)認為是活(huo)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，而染色(se)(se)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)認為是死亡細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。

經典的細胞計數常用到血細胞計數板。細胞消化成單個細胞后，將細胞懸液加入血蓋片和計數板之間的空隙中，通常我們計數計數板的四角大方格(每個大方格又分16個小方格)內的細胞數。計完數后，需換算出每ml懸液中的細胞數。由于計數板中每一方格的面積為0. 01cm²，高為0. 01cm，這樣它的體積為0. 0001cm³，即0.1mm³。由于1ml=1000mm³，所(suo)以每一大(da)方(fang)格(ge)內(nei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)數(shu)(shu)(shu)×10 000=細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)數(shu)(shu)(shu)／ml，可(ke)按下式計算：細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)數(shu)(shu)(shu)／ml=4個大(da)格(ge)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)總數(shu)(shu)(shu)／4×10000。如計數(shu)(shu)(shu)前己稀釋，可(ke)再乘稀釋倍數(shu)(shu)(shu)。計數(shu)(shu)(shu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)后，可(ke)以根據細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)計數(shu)(shu)(shu)結(jie)果，以細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)數(shu)(shu)(shu)為縱坐標(biao)，以天(tian)數(shu)(shu)(shu)為橫坐標(biao)繪制生長曲線。

目(mu)前也有多家公司(si)生產(chan)自(zi)動細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計(ji)數(shu)(shu)(shu)儀(yi)，如lifetechnology、Bio-rad等(deng)公司(si)。自(zi)動計(ji)數(shu)(shu)(shu)儀(yi)將圖(tu)像(xiang)(xiang)輸(shu)入電腦后(hou)自(zi)動計(ji)數(shu)(shu)(shu)，消除(chu)了手動細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計(ji)數(shu)(shu)(shu)的(de)(de)主觀性，消除(chu)了用戶之(zhi)間的(de)(de)差(cha)異性，可以快速準(zhun)確地(di)計(ji)數(shu)(shu)(shu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，并同(tong)時(shi)檢(jian)測(ce)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)存活率及平均大(da)小(xiao)。隨著技術的(de)(de)不(bu)斷(duan)進(jin)步，有公司(si)也推出了直(zhi)接計(ji)數(shu)(shu)(shu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)分(fen)(fen)析儀(yi)器(qi)，如Roche旗下(xia)Innovatis公司(si)的(de)(de)CASY系(xi)列細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計(ji)數(shu)(shu)(shu)分(fen)(fen)析系(xi)統，CASY細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計(ji)數(shu)(shu)(shu)儀(yi)采用*的(de)(de)電脈沖三(san)維(wei)掃(sao)描分(fen)(fen)析技術。它(ta)突破了傳統二維(wei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)成(cheng)像(xiang)(xiang)分(fen)(fen)析技術和(he)(he)染色法的(de)(de)局限，提供更加的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計(ji)數(shu)(shu)(shu)和(he)(he)分(fen)(fen)析功能。無需購買染色劑，即可、快速地(di)定量細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)濃(nong)度、體(ti)積、成(cheng)團和(he)(he)碎(sui)片。它(ta)根(gen)據測(ce)量的(de)(de)體(ti)積來計(ji)算細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)成(cheng)團，即使是嚴重(zhong)成(cheng)團的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，它(ta)也能正確定量。細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)死(si)(si)亡時(shi)，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜會破損，CASY測(ce)得的(de)(de)是細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核的(de)(de)體(ti)積，根(gen)據體(ti)積大(da)小(xiao)的(de)(de)差(cha)別，我們可以區(qu)分(fen)(fen)活細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、死(si)(si)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)以及細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)碎(sui)片。

2.檢測DNA合成

檢(jian)測(ce)DNA合成是目前檢(jian)測(ce)細胞增殖zui準(zhun)確可(ke)靠的方法，目前常用的方法有(you)如下幾種(zhong)：

(1)³H-胸腺嘧啶核苷滲入法(³H-TdR)：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA合成的前體物，處于S期的細胞不斷地攝取TdR用以合成DNA。³H-TdR摻入法是將被放射性標記的³H-TdR摻入DNA合成期的細胞，細胞內³H-TdR摻入(ru)量的多少可客觀反(fan)映細(xi)胞復制DNA能力(li)的大小，從而問接了解(jie)細(xi)胞增殖情況。通(tong)過檢測。H放射活性即可反(fan)映DNA含量。

1976年Mattem等首先(xian)采(cai)用此方法做體(ti)外藥敏(min)試驗(yan)(yan)。此后經過長期(qi)的(de)廣(guang)泛研究(jiu)，也己證實(shi)該法對各(ge)種動物腫(zhong)瘤及(ji)人(ren)類腫(zhong)瘤均(jun)有(you)較好的(de)預測(ce)價(jia)值和重復性，主(zhu)要用于細胞(bao)增殖(zhi)的(de)檢測(ce)與(yu)藥物敏(min)感(gan)性試驗(yan)(yan)等。但(dan)這種方法操作復雜，試劑含(han)有(you)同位(wei)素(su)，具(ju)有(you)放射性，對實(shi)驗(yan)(yan)者(zhe)有(you)一(yi)定的(de)危害，故(gu)限制了(le)它的(de)應用。

(2)BrdU檢測法(fa)：BrdU中文(wen)全名為(wei)5-溴脫氧(yang)尿嘧(mi)(mi)啶(ding)核苷(gan)，為(wei)胸(xiong)腺(xian)嘧(mi)(mi)啶(ding)的(de)(de)衍生物，可(ke)代替(ti)胸(xiong)腺(xian)嘧(mi)(mi)啶(ding)在(zai)DNA合成期(qi)(qi)(S期(qi)(qi))摻(chan)(chan)入(ru)，而后(hou)利用抗(kang)BrdU的(de)(de)抗(kang)體耦(ou)聯不(bu)同(tong)的(de)(de)酶，加(jia)入(ru)不(bu)同(tong)發光特性(xing)的(de)(de)底物，然后(hou)再通過比色(se)法(fa)、化(hua)學發光檢測或熒光信號檢測底物強(qiang)度(du)等(deng)步驟，反映BrdU的(de)(de)摻(chan)(chan)入(ru)量。該方法(fa)不(bu)需要再和放射性(xing)物質(zhi)打交道。

(3)EdU檢(jian)測法：BrdU雖然解決了(le)接觸同位素的(de)(de)(de)(de)問題，但(dan)該方(fang)(fang)法需(xu)要(yao)變性DNA后才能與抗體結合(he)，但(dan)這就破(po)壞了(le)DNA雙鏈結構，對某些后續或同時進(jin)行的(de)(de)(de)(de)試驗，如其(qi)他染料的(de)(de)(de)(de)結合(he)染色有影響。現在(zai)有一(yi)種(zhong)新的(de)(de)(de)(de)檢(jian)測方(fang)(fang)法能避(bi)免這種(zhong)情(qing)況的(de)(de)(de)(de)發生——EdU檢(jian)測。EdU(5-乙(yi)炔基-2’脫氧(yang)尿嘧(mi)啶核苷)也是一(yi)種(zhong)胸腺(xian)嘧(mi)啶核苷類似物，但(dan)其(qi)連有的(de)(de)(de)(de)炔羥(qian)基團在(zai)天(tian)然化(hua)合(he)物中很少(shao)見，在(zai)細(xi)胞增殖(zhi)時能夠插入正在(zai)復制(zhi)的(de)(de)(de)(de)DNA分(fen)子中，基于EdU與染料的(de)(de)(de)(de)共軛反應可以進(jin)行快(kuai)速的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞增殖(zhi)檢(jian)測分(fen)析，可以有效地檢(jian)測處于S期的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞百分(fen)數。與傳(chuan)統的(de)(de)(de)(de)免疫(yi)熒光染色(BrdU)檢(jian)測方(fang)(fang)法相比，更簡(jian)單，更快(kuai)速，更準確。