1.逐級鹽析 高鹽情況下由于與蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)表(biao)面極(ji)性基團(tuan)作(zuo)用的(de)(de)水分(fen)(fen)(fen)子(zi)減少(shao)而使得蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)溶解(jie)度(du)下降的(de)(de)現象稱為鹽析(xi)效應(ying)(ying)。不(bu)同(tong)(tong)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)表(biao)面極(ji)性基團(tuan)分(fen)(fen)(fen)布的(de)(de)不(bu)同(tong)(tong)決定對鹽析(xi)效應(ying)(ying)的(de)(de)反應(ying)(ying)不(bu)同(tong)(tong)。如50％飽和度(du)的(de)(de)硫(liu)酸銨能夠沉淀(dian)血(xue)清中(zhong)(zhong)的(de)(de)抗體(ti)分(fen)(fen)(fen)子(zi)IgG，但是(shi)(shi)血(xue)清中(zhong)(zhong)其他類型的(de)(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)需要(yao)更高的(de)(de)硫(liu)酸銨濃度(du)才能被鹽析(xi)。逐級鹽析(xi)通常在(zai)(zai)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)初步(bu)分(fen)(fen)(fen)離(li)中(zhong)(zhong)用到(dao)(dao)(dao)。核酸在(zai)(zai)高鹽溶液中(zhong)(zhong)不(bu)沉淀(dian)，所以鹽析(xi)也是(shi)(shi)濃縮蛋(dan)白(bai)的(de)(de)同(tong)(tong)時去除(chu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)制各(ge)液中(zhong)(zhong)高豐度(du)核酸污染源的(de)(de)好方法。常規的(de)(de)操作(zuo)是(shi)(shi)：在(zai)(zai)常溫攪拌(ban)的(de)(de)情況下慢慢加入飽和的(de)(de)硫(liu)酸銨溶液到(dao)(dao)(dao)初始上清液當中(zhong)(zhong)直到(dao)(dao)(dao)飽和度(du)達到(dao)(dao)(dao)20％，然后(hou)把樣品(pin)放在(zai)(zai)冷庫4～6個小(xiao)時后(hou)再離(li)心。如此重復(fu)可得到(dao)(dao)(dao)在(zai)(zai)20％，40％，60％和80％硫(liu)酸銨飽和度(du)情況下沉淀(dian)的(de)(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)。各(ge)個組分(fen)(fen)(fen)的(de)(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)可以在(zai)(zai)重新溶解(jie)和透(tou)析(xi)后(hou)檢測目標蛋(dan)白(bai)的(de)(de)位置以指導下一步(bu)的(de)(de)提(ti)純。

注：硫酸銨(an)的飽和(he)度在常溫(24℃)和(he)冷(leng)庫(4℃)間變化很小(xiao)，都是4. lM左右(you)(在1L純凈(jing)水中溶解(jie)761g硫酸銨(an)晶體)。

2.親和層析 親和(he)(he)層(ceng)(ceng)析是(shi)基(ji)于目標(biao)蛋白和(he)(he)固(gu)相(xiang)(xiang)交聯(lian)的(de)(de)載體(ti)之間的(de)(de)相(xiang)(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)而設計(ji)的(de)(de)純(chun)(chun)化策略(lve)。如可以(yi)利用(yong)(yong)含(han)固(gu)相(xiang)(xiang)交聯(lian)抗體(ti)的(de)(de)親和(he)(he)柱(zhu)純(chun)(chun)化可與(yu)之作(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)對(dui)應(ying)(ying)的(de)(de)抗原分子(zi)。另外，基(ji)于很(hen)多轉錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)有對(dui)DNA特殊序(xu)列的(de)(de)親和(he)(he)性，親和(he)(he)層(ceng)(ceng)析也被(bei)廣泛地應(ying)(ying)用(yong)(yong)于純(chun)(chun)化轉錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)的(de)(de)策略(lve)中：把含(han)有和(he)(he)目標(biao)轉錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)相(xiang)(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)DNA序(xu)列交聯(lian)在(zai)活化瓊脂(zhi)糖固(gu)相(xiang)(xiang)柱(zhu)上可以(yi)純(chun)(chun)化對(dui)應(ying)(ying)的(de)(de)轉錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)。這種方法的(de)(de)優(you)點在(zai)于每一(yi)步的(de)(de)純(chun)(chun)化倍數會很(hen)高，通常是(shi)上百倍或千倍。如果是(shi)基(ji)于抗體(ti)-抗原作(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)親和(he)(he)層(ceng)(ceng)析，被(bei)吸附的(de)(de)蛋白質(zhi)可以(yi)用(yong)(yong)低pH、高pH或含(han)尿素溶液(干擾抗體(ti)-抗原作(zuo)用(yong)(yong))洗脫；被(bei)吸附在(zai)DNA的(de)(de)轉錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)則可以(yi)用(yong)(yong)含(han)高鹽緩(huan)沖液洗脫。

3.凝膠過濾層析 凝膠(jiao)過(guo)濾層析(xi)又(you)叫分(fen)(fen)(fen)子(zi)篩層析(xi)，是基于蛋白質(zhi)天(tian)然(ran)分(fen)(fen)(fen)子(zi)量大小而設(she)計的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)離方(fang)法(fa)。分(fen)(fen)(fen)子(zi)篩的(de)(de)作用使得分(fen)(fen)(fen)子(zi)量小的(de)(de)蛋白質(zhi)在層析(xi)過(guo)程中(zhong)在柱子(zi)上(shang)滯(zhi)留的(de)(de)時(shi)段比較(jiao)長(chang)。所(suo)以。個(ge)特(te)定(ding)蛋白質(zhi)或(huo)復(fu)合體(ti)被洗(xi)脫所(suo)需(xu)的(de)(de)溶液體(ti)積與其天(tian)然(ran)分(fen)(fen)(fen)子(zi)量成負相關。這種方(fang)法(fa)不(bu)僅在初(chu)級(ji)或(huo)次(ci)級(ji)分(fen)(fen)(fen)離中(zhong)是很(hen)好的(de)(de)手段，也可以與已知分(fen)(fen)(fen)子(zi)量的(de)(de)對(dui)照蛋白平行使用來測定(ding)純(chun)化蛋白質(zhi)的(de)(de)天(tian)然(ran)分(fen)(fen)(fen)子(zi)量。

4.離子交換層析 離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)層(ceng)析是zui常用(yong)的(de)(de)基于蛋(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)與載體吸附(fu)作(zuo)用(yong)而(er)設計的(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)分(fen)離(li)(li)(li)(li)方法。蛋(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)是表面帶(dai)有多離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)基團的(de)(de)大分(fen)子(zi)(zi)(zi)。離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)層(ceng)析足以離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)劑為(wei)(wei)固定相，以特(te)定的(de)(de)含蛋(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)和溶液(ye)離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)緩沖液(ye)為(wei)(wei)流動相，利(li)用(yong)離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)劑對需要分(fen)離(li)(li)(li)(li)的(de)(de)各種蛋(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)結合力的(de)(de)差異，而(er)將混合物(wu)中(zhong)不(bu)同解離(li)(li)(li)(li)特(te)性蛋(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)進行分(fen)離(li)(li)(li)(li)的(de)(de)層(ceng)析技術。此方法具有靈(ling)敏度(du)高，重復性與選擇性好和分(fen)離(li)(li)(li)(li)速度(du)快等(deng)優點。根據離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)劑所(suo)(suo)帶(dai)電(dian)荷(he)的(de)(de)不(bu)同，可(ke)分(fen)為(wei)(wei)陰(yin)離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)劑和陽離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)劑。以陰(yin)離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)層(ceng)析為(wei)(wei)例：將交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)樹脂(因為(wei)(wei)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)劑能在(zai)溶液(ye)中(zhong)釋放出OH基團所(suo)(suo)以本身帶(dai)正電(dian)荷(he))填(tian)充在(zai)層(ceng)析柱(zhu)(zhu)內，表面帶(dai)負電(dian)荷(he)的(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)會被吸附(fu)；由于各種蛋(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)表面所(suo)(suo)帶(dai)電(dian)荷(he)的(de)(de)種類和數量不(bu)同，它們(men)被吸附(fu)的(de)(de)程度(du)也不(bu)同。然后用(yong)含陰(yin)離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(如(ru)KCl中(zhong)的(de)(de)Cl)梯度(du)的(de)(de)緩沖溶液(ye)洗柱(zhu)(zhu)，蛋(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)可(ke)依次從(cong)含電(dian)荷(he)少到多的(de)(de)順(shun)序(xu)被洗脫下來而(er)達(da)到分(fen)離(li)(li)(li)(li)的(de)(de)目的(de)(de)。

5.疏水作用層析 疏水(shui)(shui)(shui)作用層析(xi)也屬于吸附層析(xi)一類(lei)。該(gai)方(fang)法(fa)基(ji)于蛋(dan)白質(zhi)(zhi)的(de)(de)疏水(shui)(shui)(shui)差(cha)異，適用于不(bu)(bu)易被鹽析(xi)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)的(de)(de)進一步提純。在高鹽溶(rong)液中，蛋(dan)白質(zhi)(zhi)表面(mian)的(de)(de)親水(shui)(shui)(shui)／離子(zi)基(ji)團(tuan)被反(fan)離子(zi)所遮(zhe)蓋，而(er)表面(mian)的(de)(de)疏水(shui)(shui)(shui)基(ji)團(tuan)會(hui)與疏水(shui)(shui)(shui)層析(xi)柱中的(de)(de)疏水(shui)(shui)(shui)配基(ji)相(xiang)結合(he)。通常而(er)論，鹽濃度越高，蛋(dan)白與層析(xi)柱的(de)(de)疏水(shui)(shui)(shui)配基(ji)相(xiang)結合(he)形成(cheng)的(de)(de)疏水(shui)(shui)(shui)鍵越強。如在2. 5M硫酸銨條(tiao)件下能被鹽析(xi)的(de)(de)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)可以(yi)溶(rong)解在含2M硫酸銨的(de)(de)緩(huan)沖液中加樣。在洗脫(tuo)(tuo)時(shi)，將鹽濃度逐漸降低(如建立2M到(dao)40mM硫酸銨梯(ti)度)，不(bu)(bu)同(tong)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)因(yin)疏水(shui)(shui)(shui)性不(bu)(bu)同(tong)而(er)先后被洗脫(tuo)(tuo)而(er)純化。

注：疏水層(ceng)析(xi)與離(li)子交換層(ceng)析(xi)剛好互(hu)補，因(yin)此可以用于(yu)分離(li)離(li)子交換層(ceng)析(xi)或其他(ta)方(fang)法很(hen)難(nan)或不能分離(li)的蛋白質。

6.反相層析 在(zai)(zai)上(shang)面(mian)(mian)所(suo)(suo)講的(de)(de)吸附(fu)層析(xi)(xi)特別是離(li)(li)(li)子交換層析(xi)(xi)中都會出現高極性(xing)(xing)物(wu)質(zhi)(zhi)在(zai)(zai)層析(xi)(xi)柱(zhu)上(shang)吸附(fu)較牢從而(er)發(fa)生(sheng)(sheng)洗脫時(shi)的(de)(de)拖尾現象和在(zai)(zai)柱(zhu)中滯留時(shi)間過長的(de)(de)問(wen)題。反(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)層析(xi)(xi)是在(zai)(zai)固相(xiang)(xiang)(xiang)載體上(shang)涂上(shang)一(yi)層高碳(tan)原子的(de)(de)疏水性(xing)(xing)強(qiang)的(de)(de)烷烴類，而(er)洗脫液則用極性(xing)(xing)強(qiang)的(de)(de)溶劑，如(ru)甲醇和水的(de)(de)混合物(wu)。被(bei)(bei)分離(li)(li)(li)的(de)(de)粗蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)樣品中，極性(xing)(xing)強(qiang)的(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)不容(rong)易被(bei)(bei)吸附(fu)，所(suo)(suo)以(yi)能zui先洗脫下來從而(er)得到(dao)較好(hao)的(de)(de)分離(li)(li)(li)效果(guo)。這種(zhong)層析(xi)(xi)法與普通的(de)(de)吸附(fu)層析(xi)(xi)法相(xiang)(xiang)(xiang)反(fan)(fan)，所(suo)(suo)以(yi)被(bei)(bei)稱為反(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)層析(xi)(xi)。從本質(zhi)(zhi)上(shang)看(kan)，反(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)層析(xi)(xi)分離(li)(li)(li)法與疏水層析(xi)(xi)分離(li)(li)(li)法的(de)(de)依據是一(yi)致的(de)(de)，都是利用固定相(xiang)(xiang)(xiang)載體上(shang)偶聯的(de)(de)疏水性(xing)(xing)配基(ji)(ji)與流動相(xiang)(xiang)(xiang)中包(bao)括蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)表(biao)面(mian)(mian)的(de)(de)一(yi)些疏水基(ji)(ji)團發(fa)生(sheng)(sheng)可逆(ni)性(xing)(xing)結(jie)合而(er)進行分離(li)(li)(li)。反(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)層析(xi)(xi)的(de)(de)優點是分辨(bian)率好(hao)。圖4-3-2是例樣。